ceRNA即竞争性内源RNA，是一种假说，一种全新的基因表达调控模式，即ceRNA可以通过竞争性结合miRNA的位点，从而影响miRNA与mRNA的3'UTR结合，进而影响下游mRNA的表达(ceRNA-miRNA-mRNA)，影响细胞功能。这种ceRNA机制是近年来的研究热点，截至2023年5月31日，从pubmed检索ceRNA相关文章，结果有7145条，其中近三年发表的有3412篇。如此居高不下的研究热度，以及大量的高分文章，总会让人好奇关于ceRNA机制的研究是如何进行的，接下来本文将通过一篇文献来详细介绍。

题目：Lnc-AIFM2-1 promotes HBV immune escape by acting as a ceRNA for miR-330-3p to regulate CD244 expression

期刊：Frontiers in Immunology

IF：8.786

一、研究背景

慢性乙型肝炎（CHB）病毒感染是肝硬化和肝细胞癌（HCC）的主要危险因素。乙型肝炎病毒（HBV）的免疫逃逸受病毒特异性CD8+ T细胞耗竭的调控，这与负调控分子CD244的异常表达有关。然而，其潜在的机制尚不清楚。另有研究表明，非编码RNA（ncRNA），包括microRNA（miRNA）和长链非编码RNA（lncRNA）,也可能在HBV感染中发挥重要的调控作用。miRNAs通过调节靶标mRNA的表达，参与了许多重要的生物学过程，如细胞信号转导和免疫反应。lncRNAs作为一类内源性竞争RNA（ceRNAs），可以作为miRNA海绵来介导基因表达。因此，本研究假设lncRNA和CD244相互作用的证据有助于阐明细胞内和细胞间分子之间的功能关系，从而为了解对HBV免疫逃逸至关重要的生物学过程、途径和相互作用网络提供见解。

二、研究思路

三、研究结果

1. CHB中差异表达的mRNA、miRNAs和lncRNAs的鉴定

CHB患者与SC HBV患者相比，共发现513个lncRNAs、256个mRNAs和48个miRNAs存在差异表达（DE）。其中，与SC HBV患者相比，CHB患者中368个DE lncRNAs、114个mRNAs和22个miRNAs表达上调，145个lncRNAs、142个mRNAs和26个miRNAs表达下调。火山图显示，DE RNA可以区分CHB患者和SC HBV患者（图1A-C）。

图1 CHB患者与SC HBV对照组差异表达lncRNAs、miRNAs和mRNAs的火山图。

2. HBV感染诱导了CHB患者CD8+ T细胞中CD244信号通路的表达

通过GO分析研究了DE RNA的生物学功能，这支持了GO项分析中证实的免疫应答通路的作用，包括T细胞受体信号通路（图2A-C）。为了确定CD244信号通路是否参与了抗HBV免疫应答，本研究检测了CD4+ T细胞、CD8+ T细胞和NK细胞中CD244的表达水平。流式细胞仪分析显示，与SC HBV患者相比，HBV感染诱导CD244+ CD8+ T细胞和CD244+ CD4+ T细胞显著增加，而CD244+ CD16+ NK细胞没有显著增加（图2D）。此外，无论是SC HBV患者还是CHB患者的PBMCs中，CD244+ CD8+ T细胞的百分比都远远高于CD244+ CD4+ T细胞（图2E，F）。

图2 CHB患者和SC HBV对照中免疫细胞上的CD244信号表达。

3. HBV感染诱导CD244过表达促进T细胞凋亡

为了明确CD244在CHB和SC HBV的T细胞中的差异表达的调控作用，本研究建立了一个体外模型。将T细胞系Jurkat细胞与正常肝细胞系LO2或感染HBV的肝细胞系HepAD38细胞共培养（图3A）。检测HBV DNA和HBsAg，以证明与Jurkat细胞共培养的HepAD38细胞中HBV的感染（图3B，C）。与Jurkat+LO2组相比，Jurkat+HepAD38组CD244 mRNA表达水平显著增加（图3D）。而与Jurkat+LO2组相比，Jurkat+HepAD38组，细胞凋亡水平增加，说明CD244的增加与T细胞凋亡有关（图3E），同时该组HBV DNA和HBsAg显著升高。相反，CD244沉默后，HBV DNA和HBsAg水平显著降低（图3F-H）。这些数据共同表明了CD244信号通路在HBV感染期间调节CD8+ T细胞免疫应答中的重要性。

图3 CD244表达调节有或没有HBV感染的T细胞凋亡。

4. miR-330-3p通过抑制CD244的表达，增强了对HBV感染的免疫应答

为了找出调控CD244在SC HBV和CHB中差异表达的原因，本研究分析了DE miRNA。使用miRnada和TargetScan工具预测了5240个目标mRNA（图4A）。这些DE miRNAs的GO分类和KEGG通路分析显示，转录和免疫通路显著降低（图4B）。此外，生物信息学软件TargetScan预测DE miR-330-3p的靶基因可能是CD244（图4C）。然后比较CHB患者和SC HBV患者的miR-330-3p水平。RT-qPCR数据显示，CHB患者中miR-330-3p的表达明显降低（图4D）。此外，与Jurkat+LO2组相比，Jurkat+HepAD38组（HBV感染组）miR-330-3p的表达显著降低（图4E），CD244 mRNA表达水平显著升高（图3D）。相反，在与Jurkat细胞共培养的HepAD38细胞中，miR-330-3p模拟物刺激后，HBV DNA和HBsAg显著降低（图4F-H）。

为研究has-miR-330-3p与CD244 mRNA之间的相互作用，将mimics NC、has-miR-330-3p mimics、ASO-NC和has-miR-330-3p ASO分别转染与Jurkat共培养的HepAD38细胞。在证实miR-330-3p的mimics和ASO正常工作后，本研究发现miR-330-3p mimics降低了CD244的mRNA和蛋白水平，ASO miR-330-3p显著增加了CD244的表达（图4I，J）。为了进一步探讨miR-330-3p是否通过直接结合作用靶向CD244，采用双荧光素酶实验设计。结果显示，CD244-3‘UTR-wt组添加miR-330-3p mimics相比添加miR-330-3p NC萤火虫荧光素酶活性显著降低，而添加ASO miR-330-3p相比添加ASO NC萤火虫荧光素酶活性显著升高；CD244-3‘UTR-mut组无显著差异（图4K）。此外，转染CD244质粒过表达CD244，CD8+ T细胞的凋亡明显增加（图4L）。通过siRNA抑制CD244，挽救了ASO miR-330-3p诱导的T细胞的凋亡（图4L）。结果表明，has-miR-330-3p通过直接相互作用靶向CD244。

图4 miR-330-3p通过CD244改变调节对HBV感染的免疫应答。

5. Lnc-AIFM2-1作为miR- 330-3p的ceRNA，调控CD244的表达

结合lncRNA/miRNA相互作用和miRNA/mRNA相互作用，这些RNA的热图表明上调的lncRNA可以区分CHB患者和SC-HBV患者（图5A）。本研究发现lnc-AIFM2-1和CD244与miR-330-3p具有相似的结合位点（图5B）。因此，比较了CHB患者和SC HBV患者中lnc-AIFM2-1的水平。RT-qPCR数据显示，CHB患者中lnc-AIFM2-1的表达显著增加（图5C）。为了研究has-miR-330-3p和lnc-AIFM2-1之间的直接相互作用，设计了双荧光素酶实验。结果显示，miR-330-3p模拟物显著抑制了lnc-AIFM2-1的表达，miR-330-3p ASO增加了lnc-AIFM2-1的表达，而lnc-AIFM2-1-3‘UTR-mut抑制了它们的表达（图5D）。另外，通过转染lnc-AIFM2-1质粒过表达了lnc-AIFM2-1，并通过转染lnc-AIFM2-1 siRNA降低了lnc-AIFM2-1的表达（图5E）。此外，lnc-AIFM2-1的上调导致了miR-330-3p的降低和CD244的升高（图5F，G）。CD244的蛋白表达变化与mRNA一致（图5H）。此外，lnc-AIFM2-1的下调导致miR-330-3p升高，CD244水平降低（图5F，G）。过表达lnc-AIFM2-1组中CD8+ T细胞的凋亡相对过表达对照组明显增加（图5I）。相反，lncAIFM2-1 siRNA组的CD8+ T细胞凋亡相对敲低对照组减少（图5I）。此外，与lnc-AIFM2-1质粒+模拟物NC组相比，miR-330-3p模拟物的处理显著抑制了CD8+ T细胞的凋亡（图5J）。与lnc-AIFM2-1质粒+模拟物NC组相比，miR-330-3p模拟物处理后的HBV DNA和HBsAg水平也显著降低（图5K，L）。这些数据表明，lnc-AIFM2-1作为miR-330-3p的ceRNA，参与了HBV的免疫逃逸。

图5 lnc-AIFM2-1与miR-330-3p相互作用调节免疫应答。

原文链接：

https://www.frontiersin.org/articles/10.3389/fimmu.2023.1121795/full