生信碱移

recall: 细胞自动聚类

Recall 通过人工生成随机的噪声假基因判断细胞聚类簇是否拆得过细，如果过细就自动往回合并或者调整分辨率，从而得到优化的聚类。

单细胞 RNA 测序（scRNA-seq）能够分析包含数千至数百万个单细胞转录组图谱的数据集。主流分析流程 seurat 与 scanpy 一般包括以下三个大步骤：

1. 预处理（质控、归一化、选 HVGs、PCA）

2. 无监督聚类（在 PCA 空间构建的邻接图上 执行Louvain或Leiden聚类算法）

3. 细胞marker识别，在得到的聚类簇上做差异表达（DE）分析，从而定义细胞类型和marker gene。

经常分析的铁子都知道，单细胞流程分辨率参数、邻居数等都很主观，细胞聚类本身本身是一拍脑袋的操作。换句话说，分辨率调的越大，理论上单细胞簇能够被无限细分。

具体到分析的时候，如果聚类的时候过度细分了，很多 cluster 其实没什么太大差别，注释的时候就麻烦起来了。不仅如此，考虑到单细胞的 FindAllmarker 函数本质上是一对多的差异分析，这个时候无论如何其实都容易检测出差异基因。画热图的时候可能就会发现问题，比如一些聚类具有类似的 marker 基因。

图：聚类簇具有一样的top基因。

前几天看到一个有意思的 R 包 recall，原理比较易懂，代码也非常简单，甚至名称也很好记，这种好东西还是得给各位佬哥佬姐分享分享。R 包对应的文章今年4月3日发表于老牌期刊 AJHG [IF:8.1]。

DOI: 10.1016/j.ajhg.2025.02.014.

简单来说，recall 往基因表达矩阵里放入一批人造假基因，这些基因被设计成不可能代表真实细胞类型差异的阴性对照。然后，recall 对假基因跟真基因一起进行聚类和差异分析。在此基础上，根据假基因与真实基因的结果判断聚类簇是否拆得过细，如果过细就自动往回合并或者调整分辨率，从而得到优化的聚类。

图：recall 方法流程。a.recall 在原始表达矩阵中为每个真实基因构造若干人造基因（作者称为人工变量），使其在边际分布与共变结构上逼近真实基因，但在设计上与细胞类型独立，生物学上仅代表背景噪音。人工基因与真实基因一同参与降维、聚类和差异表达分析。作为负对照：真实的细胞类型差异不应主要体现在这些人工变量上。因此，若任意两个聚类簇之间大量人工基因被判为显著差异基因，则说明当前簇划分缺乏可信的表达差异支撑；此时算法据此合并相关簇或下调聚类分辨率并重新聚类，从而抑制过度聚类并获得统计上更稳健的簇结构。b-d.recall 能够聚类出真实的细胞差异群体。

本文简要介绍 recall 方法的使用流程，感兴趣的铁子可以阅读原文了解过更多信息。

• https://github.com/lcrawlab/recall

0.R包安装

可以使用如下代码安装该R包：

devtools::install_github("lcrawlab/recall")
# presto并不是一个明确的依赖项，但安装 presto 会使 recall 更快
#devtools::install_github("immunogenomics/presto")

需要注意的是recall仅支持 Seurat v5 版本，如果大家用的是 v4 的话，需要再更新或者同时安装一个 v5 版本的包。这里小编同时安装了v5和v4，所以指定v5的安装路径进行引用：

library(Seurat, lib.loc = "D:/Software/R/R-4.4.0/seuratv5/")
library(SeuratData, lib.loc = "D:/Software/R/R-4.4.0/seuratv5/")
library(recall)

01.recall使用

recall的代码流程非常简单，只需使用FindClustersRecall代替FindClusters函数即可，这里使用10X的外周血单个核细胞数据进行展示。

① 先加载一下数据为 seurat 对象af：

set.seed(123)

af <- readRDS("af.rds")
af <- UpdateSeuratObject(af) # v4结构转v5

② 走一下常规标准化PCA流程：

af <- NormalizeData(af)
af <- FindVariableFeatures(af)
af <- ScaleData(af)
af <- RunPCA(af)
af <- RunUMAP(af, dims = 1:10)

③ 这里展示一下 seurat 流程与 recall 的差异。

首先是seurat的流程，分辨率按照默认选个0.8看看：

# seurat
af_seurat <- FindNeighbors(af, dims = 1:10)
af_seurat <- FindClusters(af_seurat, resolution = 0.8)

然后是recall的流程，直接使用FindClustersRecall函数替换即可：

# recall
af_recall <- FindClustersRecall(af, 
                                resolution_start = 0.8, 
                                reduction_percentage = 0.2, 
                                num_clusters_start = 20, 
                                dims = 1:10, #  KNN使用的PCA维度
                                algorithm = "louvain")

几个参数如下，具体的细节可以再看看原文：

• resolution_start = 0.8：设置初始聚类分辨率，数值越大初始簇越多，作为起点供后续合并校准。

• reduction_percentage = 0.2：每次发现过度聚类时收缩聚类复杂度的比例（20%），控制逐步合并/降分辨率的程度。

• num_clusters_start = 20：指定初始期望簇数规模，大致从约 20 个簇起步再由算法自动调整。

• dims = 1:10：用于构建 KNN 图和聚类的 PCA 维度范围，这里使用前 10 个主成分。

• algorithm = "louvain"：选择使用 Louvain 图社区检测算法进行聚类。

最后比较一下两者的结果：

p1 <- DimPlot(af_seurat) + ggplot2::ggtitle(label = "Seurat cluter")
p2 <- DimPlot(af_recall) + ggplot2::ggtitle(label = "Recall cluter")
p1+p2

高下立判

这不得赶紧试试