引言

邻近标记（PL）技术通过基因编码的酶，在活细胞原位将标签共价连接到邻近蛋白，无需直接物理结合即可捕获弱相互作用、瞬时互作及空间邻近蛋白，显著提升了蛋白质组学研究在原位空间图谱绘制中的分辨率，为解析细胞器接触位点、无膜细胞器（如相分离液滴）及动态信号转导复合物提供了高分辨率技术支撑。

面对邻近标记酶，BioID家族（BioID/BioID2/TurboID/AirID/ultraID）与过氧化物酶家族（APEX/APEX2）各有千秋，其酶学特性、标记效率与应用场景的差异，常令研究者难以抉择。

为此，我们将基于PubMed、Web of Science、Protocols.io等权威数据库的文献，对这些常用和新兴的标记酶进行详尽的酶学特性剖析，以及应用场景的深度探讨，全方位解析“如何为特定的生物医学问题选择最合适的工具”。

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01 邻近标记的生化机理与酶学分类

邻近标记技术依据催化反应化学性质及所需底物，主要分为两大类：生物素连接酶衍生标记系统和过氧化物酶衍生标记系统，理解两类酶的核心生化逻辑是实验设计与结果解读的基础。

1. 生物素连接酶家族：从BirA到TurboID的定向进化

该类技术源于大肠杆菌的生物素连接酶BirA，其天然功能是将生物素与ATP结合生成高活性、不稳定的生物素酰-5'-腺苷酸中间体，并特异性转移至乙酰辅酶A羧化酶（BCCP）亚基的特定赖氨酸残基。通过定向改造BirA的结构与动力学特性，衍生出系列功能变体：

① BioID：经R118G单点突变，使中间体“泄漏”并标记邻近蛋白（伯胺反应），标记半径约10nm，但催化效率极低，需18-24小时标记，仅适用于稳态复合物研究。

② BioID2：删除BirA的N端DNA结合结构域，分子量从35kDa降至27kDa，减少空间位阻，优化生物素亲和力，仍需16小时以上标记，时间分辨率无突破。

③ TurboID/miniTurbo：经定向进化获得的高活性变体，催化效率比BioID高100倍，10分钟即可获得强信号，时间分辨率达“分钟级”；miniTurbo（28kDa）体积更小，背景噪音低但稳定性较差。二者的不足是高活性易导致内源生物素消耗，引发背景标记与细胞毒性。

2. 过氧化物酶家族：自由基介导的秒级标记

与生物素连接酶的温和反应不同，过氧化物酶系统（APEX/APEX2）源自抗坏血酸过氧化物酶，经改造后采用激进的自由基化学机制催化苯酚衍生物氧化。

▶ 反应机理：在过氧化氢（H2O2）存在下，催化生物素-苯酚生成生物素-苯氧基自由基，该自由基半衰期<1毫秒，扩散距离<20nm，快速与邻近蛋白的酪氨酸、色氨酸等富电子残基共价交联。

▶ 核心优势：标记仅需45-60秒，具备“快照”式秒级时间分辨率，是瞬态过程（如神经突触传递）研究的关键工具。

▶ 标记偏好差异：与生物素连接酶家族（主要标记赖氨酸，富集RNA加工、蛋白定位相关蛋白）相比，APEX2侧重标记酪氨酸，在代谢通路相关蛋白富集中更具优势，二者形成蛋白质组覆盖互补。

3. 新兴酶学工具：AirID、ultraID与其他变体

随着邻近标记技术的普及，研究者们不断开发新型酶以解决BioID（慢）和TurboID（背景高、毒性大）之间的矛盾，力求在活性、特异性和生物兼容性之间找到最佳平衡点。

① AirID：祖先序列重构的低毒高效工具

▶ 设计思路：未依赖大肠杆菌BirA突变，而是通过宏基因组数据与祖先序列重构算法，推导出BirA家族的祖先序列，创新设计逻辑。

▶ 核心特性：分子量约35kDa，标记动力学介于BioID与TurboID之间（1-3小时即可获得强信号）；生物兼容性优异，长时间表达与标记对细胞毒性极低，适配小鼠、发育生物学模型等长时程体内实验；低生物素浓度下表现优于BioID，融合蛋白稳定性高于miniTurboID，减少假阴性。

② MicroID与UltraID：极致小型化的高性能变体

▶ 结构突破：MicroID通过截去BioID2的C端非结构域并引入突变，分子量降至20kDa以下；UltraID（约19kDa）在MicroID基础上新增R40G/L41P突变，进一步优化性能。

▶ 核心优势：UltraID兼具TurboID的速度（10分钟标记）与BioID2的低背景特性，19kDa的小巧体积使其成为膜蛋白、核孔复合物等空间受限区域研究的理想选择，部分膜结合蛋白相互作用研究中，信噪比优于TurboID和BASU。

③ BASU与Pup-IT：其他技术路径的探索

▶ BASU：源自枯草芽孢杆菌的生物素连接酶，早期文献声称动力学极快（1分钟），但后续独立研究证实其表现不稳定，需较长标记时间才能达到BioID水平，应用存在争议；

▶ Pup-IT：基于原核生物类泛素化系统的标记技术，利用PafA酶将小蛋白Pup连接到邻近蛋白上，无内源性背景（哺乳动物细胞无Pup系统），但Pup分子量较大可能干扰底物识别，操作流程较生物素系统更复杂。

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02 特殊应用场景与案例分析

1. 神经科学：突触蛋白组与活体脑图谱

神经元极性结构复杂，突触间隙蛋白质组难以通过传统生化方法分离。

▶ APEX2的应用：对培养神经元突触间隙进行1分钟标记，成功鉴定神经递质受体复合物的动态变化；

▶ TurboID的在体突破：通过立体定位注射Cre依赖性TurboID的AAV病毒或构建Rosa26-TurboID转基因小鼠，实现特定脑区、特定细胞类型（如多巴胺能神经元、星形胶质细胞）的在体蛋白质组标记，喂食含生物素饲料/饮水7天即可获得强信号，揭示不同脑区星形胶质细胞异质性。

2. 植物生物学：温度是关键

BioID最适温度为37°C，而拟南芥等模式植物生长温度多为22°C，低活性限制了其在植物研究中的应用。

▶ TurboID的革命：在室温（25°C）及更低温度下仍保持极高活性，成为植物领域首选工具；

▶ 案例：利用TurboID标记植物免疫受体NLR（如烟草N蛋白），成功鉴定病原菌诱导下的动态互作网络，这是传统BioID无法实现的。

3. 细胞器接触位点：Split系统的精妙应用

内质网-线粒体接触位点是脂质转运和钙信号传导的枢纽，结构脆弱易被传统分离方法破坏。

▶ Split-TurboID方案：将TurboID拆分为无活性的N端和C端片段，分别融合到内质网膜蛋白和线粒体外膜蛋白上，仅在两者物理接触的纳米尺度界面上，酶片段重组恢复活性，可特异性标记并纯化接触位点蛋白质组，排除非接触区域干扰。

4. 病毒学：宿主-病原体相互作用

病毒感染过程中，病毒蛋白与宿主蛋白的相互作用多为瞬时且发生于特定复制区室。

▶ HIV-1研究：利用BioID融合的HIV-1蛋白，揭示病毒核输入过程中与宿主核孔蛋白的相互作用机制；

▶ AirID的应用：低细胞毒性且耐受抑制剂的特性，使其被用于筛选阻断病毒蛋白-宿主因子相互作用的小分子药物，为药物筛选提供新平台。

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03 综合比较与选择指南：决策矩阵

面对如此众多的酶，研究者应如何做出选择？以下是基于关键实验参数的决策矩阵。

表1. 主流邻近标记酶特性详表  

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04 场景导向的选择建议

1. 需要极高的时间分辨率（秒级）：

▶ 首选：APEX2。适用于捕捉GPCR激活、离子通道开关或快速囊泡运输。

▶ 警告：需确认细胞能耐受H2O2，且Biotin-Phenol能渗透到目标区域（植物或厚组织切片慎用）。

2. 活体动物或植物实验：

▶ 首选：TurboID。其高活性克服了体内生物素分布不均和低温（植物）的限制。

▶ 备选：AirID。如果实验周期长（如数周的发育观察），AirID的低毒性更具优势。

3. 对融合蛋白大小敏感（如标记小蛋白或病毒衣壳）：

首选：ultraID或BioID2。小于20kDa的ultraID是目前的最小选择，能最小化空间位阻。

4. 关注背景控制与特异性（如低丰度蛋白）：

▶ 首选：miniTurbo或ultraID。虽然TurboID最快，但其高背景可能淹没低丰度信号。miniTurbo和ultraID提供了更好的信噪比。

▶ 策略：配合3-4小时的生物素耗竭预处理。

5. 研究特定的亚细胞接触结构：

首选：Split-TurboID。相比Split-BioID，其信号强度更高，能够在合理的时间内（<4小时）富集到接触位点蛋白，避免了过长时间标记导致的非特异性扩散。

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05 结论与展望

邻近标记技术已经从一个单纯的“互作伙伴发现工具”演变为解析细胞空间组织的“显微镜”。从BioID的温和但缓慢，到TurboID的激进与高效，再到APEX2的精准快照以及AirID/ultraID的理性设计，工具箱的丰富使得研究者可以根据生物学问题的具体需求（时间尺度、空间尺度、生理环境）量体裁衣。

未来的技术演进将聚焦于三个方向：一是化学探针的革新：开发具有可光解、可点击化学特性的新型生物素衍生物，以进一步提高富集的特异性；二是酶的定向进化：创造出更小、更快且对内源生物素不敏感的“正交”酶系统；三是与单细胞测序及超分辨成像的融合：实现从单细胞维度同时解析转录组与空间蛋白质组的多模态分析。

对于生物医学研究者而言，掌握这些工具不仅意味着能画出一张更全的“蛋白网络图”，更意味着能动态地看到这些网络如何在疾病、药物或发育过程中重编程，以此揭示生命的分子机制。

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研究动态、瞬时、弱相互作用的最佳工具—PL-MS蛋白邻近表达筛选解决方案

基于邻近标记技术联合质谱推出PL-MS蛋白邻近表达筛选解决方案，提供从细胞构建培养、亲和富集实验到质谱高通量筛选（阶段可选）：①目标序列获取和质粒克隆构建、②基因编辑和细胞系构建、③细胞培养和临近标记、④生物素标记蛋白的亲和纯化富集、⑤蛋白提取和酶解、⑥质谱检测和⑦数据分析和互作网络构建。

▶ 弱/动态/瞬时互作：基于空间临近标记的特殊原理，可以动态捕获更多弱相互作用和瞬时相互作用的蛋白；

▶ 高亲和性：链霉亲和素的亲和效价强，且无需严格保证非变性条件，可以捕获更多膜蛋白的互作；

▶ 避免阴性结果：基于质谱定量数据进行无偏见的高通量筛选，可以获得大量蛋白相互作用信息，避免阴性结果；

▶ 精准筛选：基于定量差异、蛋白功能注释、互作网络核心节点等多维度分析，提供候选临近表达蛋白的清单；

▶ 原位精准表达：可选目标基因的原位标签表达，保留基因天然表达模式，提升研究科学性。

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参考文献

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