一段话总结

斯坦福大学等团队开发的IsoPairFinder，是一款专为基因编辑微生物的稳定同位素示踪（SIT）代谢组学数据设计的计算工具，通过分析配对的未标记（¹²C）和同位素标记（¹³C）数据，结合 “差异分析→合并冗余离子→¹²C/¹³C 特征配对” 核心流程，减少 50-99% 假阳性并优先筛选基因扰动相关的代谢通路中间体；该工具以开源 R 包（https://github.com/DoddLab/IsoPairFinder）和 GNPS2 网页工作流形式提供，支持无编程基础用户使用，在肠道细菌尿酸（UA）代谢研究中成功筛选出 4 个关键中间体并重建代谢通路，有效解决了传统 SIT 工具不适配基因扰动实验的痛点，加速微生物代谢通路的发现与验证。

思维导图

详细总结

一、研究背景

微生物代谢通路是细胞功能的核心，但超过 50% 的微生物代谢基因功能未被注释，限制了微生物代谢在健康、生物技术领域的应用。当前技术已实现基因编辑（如 CRISPR、转座子突变）的系统化扰动，但传统稳定同位素示踪（SIT）代谢组学工具（如 X13CMS、Miso）存在关键缺陷：

未针对基因扰动实验优化，无法有效关联 “基因变化 - 代谢中间体积累”；

非靶向代谢组学中全局代谢变化易掩盖通路特异性信号；

质谱数据中的加合物（adducts）、中性丢失（neutral losses）、源内碎片（ISF）易产生假阳性，干扰中间体筛选。

二、工具核心设计与实验框架

1. 实验设计原则

IsoPairFinder 需基于 4 组对照样本设计，确保精准捕捉基因扰动对代谢的影响，具体分组如下：

2. 核心工作流程（5 步）

IsoPairFinder 通过标准化流程实现 “从原始数据到通路中间体” 的精准筛选，关键参数与操作如下：

数据导入

必需输入：4 类文件（均支持 CSV/mzML/mzXML 格式）

• 特征表（来自 XCMS/MS-DIAL/MZmine 等峰提取工具，需轻微格式调整）；

• 样本信息表（定义分组与标记类型）；

• 原始 MS1 数据（用于离子合并）；

• 原始 MS2 数据（用于 ISF 识别）。

差异分析

• 分析逻辑：分别对 “¹²C 组” 和 “¹³C 组” 进行 WT 与突变体的特征强度对比；

• 筛选标准：P 值 < 0.05（Student’s t 检验）且fold-change>10，结合 Benjamini-Hochberg FDR 校正；

• 目的：聚焦基因扰动直接影响的代谢特征，减少后续分析冗余。

合并冗余离子

• 处理对象：电喷雾电离产生的冗余离子（41 种加合物、58 种中性丢失、ISF）；

• 操作逻辑：以 ¹²C 组差异特征为基准，在 ±3 秒保留时间窗口内匹配相关离子，通过m/z 公差 ±25 ppm（加合物 / 中性丢失）和MS/MS 光谱匹配（ISF）识别冗余；

• 效果：移除假阳性特征，提升后续配对准确性。

¹²C 与 ¹³C 特征配对

核心步骤：
① 基于精确质量和7 条黄金法则预测 ¹²C 特征的化学 formula（仅考虑 CHNOPS 生物常见元素）；
② 计算对应 ¹³C 标记特征的理论 m/z；
③ 按m/z 公差 10 ppm和保留时间公差 3 秒匹配实测与理论特征；

目的：锁定基因扰动后积累的、具有同位素标记特征的通路中间体。

结果输出

核心输出：

• 特征对详情（m/z、保留时间、质量差、预测化学 formula、标记原子数）；

• 差异分析报告（含冗余离子识别结果）；

• 镜像提取离子色谱图（用于视觉验证特征对可靠性）。

三、工具核心优势（与传统 SIT 工具对比）

IsoPairFinder 在功能设计上针对基因扰动实验做了专属优化，优势如下表所示：

四、案例研究：肠道细菌尿酸代谢通路发现

为验证工具有效性，研究团队以肠道细菌尿酸（UA）降解通路为对象开展实验，具体如下：

实验设置：

• 菌株：梭状芽孢杆菌（Clostridium sporogenes）的 7 个单基因突变株（CRISPR/ClosTron 构建）；

• 底物：未标记 UA 和 [¹³C₅]- 标记 UA（培养 48 小时）；

• 检测：HILIC 柱 LC-MS/MS（MS1+MS2），原始数据用 MS-DIAL 处理。

关键结果：

• 假阳性过滤：IsoPairFinder 将理论特征对从 725 个筛选至 4 个高置信候选（以 ygeW 突变株为例）；

• 中间体鉴定：通过特征对（191.0747@5.417_196.0914@5.414）的质量差（提示 5 个 ¹³C 标记）和化学 formula（C₅H₁₀N₄O₄），确定中间体为 2,3 - 二脲基丙酸；

• 通路重建：最终通过化学标准品验证 4 个中间体结构，成功解析 UA→短链脂肪酸的代谢通路，解释了人类尿酸酶缺失后肠道菌的代偿机制。

五、可用性与资源支持

六、结论与未来展望

IsoPairFinder 填补了 “基因扰动 + SIT 代谢组学” 分析工具的空白，可广泛应用于微生物、哺乳动物细胞、模式生物等具备基因编辑工具的系统，助力新型代谢通路、天然产物的发现。未来将通过整合 SIRIUS 等 MS/MS 结构解析工具，进一步提升中间体注释的完整性；同时推荐优先使用 ¹³C 标记以减少保留时间偏移，优化分析精度。

关键问题

问题 1：IsoPairFinder 在设计上如何针对性解决传统 SIT 代谢组学工具不适配基因扰动实验的痛点？

传统 SIT 工具的核心痛点是 “无法关联基因扰动与代谢变化”“假阳性高”“兼容性差”，IsoPairFinder 通过3️⃣方面设计针对性解决：

1. 专属实验框架：强制要求 4 组对照样本（¹²C-WT/¹²C - 突变体 /¹³C-WT/¹³C - 突变体），通过 “突变体 vs WT” 的差异分析直接捕捉基因扰动引发的代谢中间体积累，而非仅分析同位素流向；

2. 假阳性精准控制：新增 “合并冗余离子” 步骤，系统识别并移除 41 种加合物、58 种中性丢失及 ISF，结合 “m/z 10 ppm+RT 3 秒” 的配对公差，可过滤 50-99% 的理论假阳性特征对；

3. 遗传 - 代谢关联能力：通过 “差异分析（锁定基因相关特征）→同位素配对（确认通路中间体）” 的串联流程，直接建立 “基因敲除→中间体积累” 的因果关系，而传统工具仅能追踪同位素标记，无法关联基因变化。

问题 2：在 IsoPairFinder 的工作流程中，“差异分析” 和 “¹²C/¹³C 特征配对” 两个关键步骤的核心参数、操作逻辑及目的分别是什么？

两个步骤的核心细节如下：

问题 3：肠道细菌尿酸代谢的案例研究中，IsoPairFinder 的有效性通过哪些具体结果得到验证？这些结果对代谢通路研究有何价值？

有效性验证及价值如下：

1. 假阳性过滤能力：以 ygeW 突变株为例，工具将理论上的 725 个特征对筛选至 4 个高置信候选，过滤效率达 99.4%，证明其能精准排除冗余信号；

2. 中间体鉴定准确性：通过特征对（191.0747@5.417_196.0914@5.414）的质量差（提示 5 个 ¹³C 原子）和预测化学 formula（C₅H₁₀N₄O₄），成功鉴定出 2,3 - 二脲基丙酸，后续经化学标准品验证无误；

3. 通路重建价值：最终验证 4 个关键中间体结构，完整解析 “尿酸→短链脂肪酸” 的代谢通路，解释了人类尿酸酶缺失后肠道菌的代偿机制，为微生物代谢通路的 “基因扰动→中间体筛选→通路验证” 提供了标准化流程，证明 IsoPairFinder 可加速未知代谢通路的发现效率。

参考

bioRxiv[Preprint]. 2025 Aug 22:2025.08.18.670916. doi: 10.1101/2025.08.18.670916

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